1、能够溶解待测物质；

2、不影响待测物质检测；

3、能够在一定时间范围内保持待测物质稳定。

什么是溶剂效应？

样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会造成的峰展宽、峰分叉现象。即色谱图上较早洗脱的峰前沿或者开叉，与此同时较晚洗脱的峰则较为正常的现象。这些现象可能是由以下原因引起的——样品溶液的溶剂很可能强于流动相。

可能发生溶剂效应的情况：

出峰时间早；保留弱；进样量大。

上图中，色谱图上较早洗脱的峰扭曲变形或者开叉，与此同时较晚洗脱的峰则较为尖锐与对称，这些现象显示一个比较特殊的起因――样品溶液的溶剂很可能强于流动相。此种强溶剂效应的例子在左图中可见。此处的样 品溶液的溶剂是100%乙腈(100%的强溶剂)，而流动相的组成则较弱，18%的乙腈与72%的水。第一个峰是开叉的，并且与第二个峰相比，明显地变宽 了。当样品溶液的溶剂变成流动相时，所有的峰形都改善了，且变得尖锐。见右图。

为什么呢？这是因为当样品进样时，有可能出现峰展宽，最佳的样品溶液组成和体积将会保持在10%甚至更低，在这个例子里，当样品溶剂与流动相溶剂强度不同时，换句话来说，也就是样品未用流动相溶解，因此，有些样品分子溶解在强溶剂中，并随强溶剂流过柱子，而有些则溶解在流动相中，从而导致峰分叉。

当样品与流动相强度相差较小，进样影响也会小，第一个峰可能会宽于第二个峰，而当这种展宽导致必要的分离度降低时，这样情况应引起注意，在左图中，使用一根短柱，和5μL进样，这与最佳进样体积4μL相近，用了极性更强的溶剂导致分离度明显的降低，从2.1降到1.5(如右图，分离度为2或更大是评估一个完善方法的一个必要参数，也是每个方法的验证参数，1.5只是一个基本的分离度，任何一个方法或一根柱子都必需满足这个条件，当进样为一倍时，也就是10μL时，分离度更一步降低，此方法就不行了。

液相色谱系统的很多问题都能在谱图上反映出来，其中一些问题可以通过改变设备参数得到解决，而其它的问题必须通过修改操作程序来解决。

样品溶剂选择不当的解决方法

HPLC溶剂的要求

(1) 高纯度，溶剂与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度要求也高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。

(2) 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性，即足够的溶解能力。溶剂的极性要与待测样品相匹配，如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响纯化分离，且会使柱子恶化。

(3) 溶剂要与检测器匹配

对于UV-Vis，所用流动相在检测波长下应没有吸收或UV 吸收很小。

(4) 化学稳定性好

不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。

(5) 低粘度，沸点适中

减小溶质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效。

常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等；粘度过低的溶剂也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

HPLC溶剂关键性能

(1) UV吸收性

HPLC级试剂是用特殊方法生产的含有最少的颗粒和最低的紫外吸收物质，除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规定值以内。

(2) 梯度洗脱性能

在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。

采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度。

① 溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能作为梯度洗脱的流动相。

当有机溶剂和缓冲液混合时，可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

② 纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

③ 防止压力过大。

混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。

例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。

反相液相色谱

(柱效高、分离能力强、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。适用于非极性-中等极性组分)

固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱

流动相：流动相极性 > 固定相极性 极性大的甲醇-水或乙腈-水

HPLC里面的溶剂效应是如何产生的，该如何避免？如何判断分叉的峰是否由溶剂效应造成，第一就是通过HPLC仪器比对一下两个劈叉峰的紫外吸收波谱，看看他们是否能完全一样的μV特征吸收，第二将进样体积调节到0.1μl看看，峰是否好转，如果满足上面两个条件几乎就可以肯定是100%的溶剂效应。产生原因：

1、样品溶液的溶剂很可能强于流动相。例如样品溶液的溶剂是100%乙腈(100%的强溶剂)，而流动相的组成则较弱，18%的乙腈与72%的水；

2、就是进样量比较大；

3、样品的pH值与HPLC流动相pH悬殊，比如酸性流动相体系，样品pH偏碱性(pH=10),这种情况下也很有可能发生 其实上面三个原因归结起来就是一个原因，那就是样品的溶剂与流动相存在一些不一样，当样品进入流动相的时候，由于这种巨大的差异，一部分样品溶解进入了流动相，一部分还留在进样的溶剂里面，所以在HPLC上出现了保留的差异，所以要解决这个问题的最佳方案就是，使用流动相的起始梯度溶解样品，如果由于溶解度的问题，不得不改用其余的溶剂，那就只能降低进样体积来解决，比如 5μl，1μL。

GC-MS 测定PAHs，HP-5MS (Agilent) 柱，固相萃取后使用甲醇洗脱。用甲醇做溶剂，是否会影响柱效和柱寿命。是否是最佳选择？甲醇的沸点比较高，极性比较大，如果换成正己烷类的弱极性，低沸点，配合一定的色谱条件可以实现溶剂聚焦作用，显著提高保留时间较短的化合物的灵敏度和检出线。甲醇相对于正己烷等极性小的溶剂，造成的柱流失大，国外用乙腈做GC-MS溶剂的文献很多，很多用来减少前面溶剂转换步骤，结合大体积进样等，溶剂先挥发分流走掉，从而进入柱子乙腈溶剂的较少，可认为对柱子影响不大，同时甲醇乙腈对比，乙腈的柱流失要少。

现有个样品，其结构中只有孤立的C=O。由于样品溶于乙醇，所以第一次做紫外扫描时就以乙醇作为溶剂。结果在202nm处测得了最大吸收。检测该化合物的HPLC条件是以乙腈－水作为流动相的。我用流动相作为溶剂再对该化合物进行紫外扫描。结果在197nm处测得了最大吸收。而在200～400nm范围内仅在285nm处测得一很小的吸收峰。在做紫外扫描时，样品溶剂不同，测得的样品的最大吸收波长也会不同。如果用HPLC-UV检测该化合物，波长选为202nm(以乙醇作为溶剂测得的)，是否合适呢？在做HPLC检测时，样品的溶剂如果不是流动相之一，会不会影响检测结果呢？C=O在270～300nm有较弱的紫外吸收(ε=10～100)，285nm的峰应为C=O的吸收。乙腈-水的极性强于乙醇，由于N-π跃迁的存在，将发生蓝移(最大吸收202变为197)，在紫外区的边缘测定有关物质则干扰甚大，不合适；测定含量勉强可以，如果仅测定含量可以根据吸收情况适当增加到210nm左右。如果溶剂跟流动相一样，那紫外吸收也应该一致，否则样品就非完全同一物质。紫外测定选择最大吸收波长进行含量测定，可以提高检测灵敏度，减少其他干扰，但这是相对的。